PRODUCCIÓN PILOTO
DE HIDROLIZADO DE RESIDUOS DE PESCADO
POR FERMENTACIÓN EN SUSTRATO SÓLIDO
CON HONGOS FILAMENTOSOS

Índice

1. Introducción
2. Metodología
3. Resultados
4. Discusión
5. Conclusión
6. Bibliografía

El propósito del presente trabajo fue elaborar a nivel piloto un hidrolizado de residuos de pescado por fermentación en sustrato sólido con hongos filamentosos.

El Perú es uno de los países que tiene el privilegio de tener un mar aledaño con una riqueza marina especial y de grandes volúmenes. La elaboración de harina de pescado es el principal producto que comprende alrededor del 90% del total de la pesca. La elaboración de otros productos pesqueros, aunque de menores volúmenes, también es significativa resultando alrededor de 300 a 400 mil TMB de residuos de pescado por año(1), los cuales son arrojados al mar o al ambiente y, en menor proporción, utilizados para la elaboración de harina de baja calidad.

El aprovechamiento del pescado para elaborar productos hidrolizados de consumo humano (2, 3, 4) y animal (5) ha sido demostrado anteriormente. Todos ellos utilizaron la tecnología de la fermentación sumergida y bacterias lácticas para hidrolizar el pescado; sin embargo, se presentan los siguientes problemas: (a) la proteína se encuentra diluida (7-10%), (b) la deshidratación del hidrolizado encarece un producto de relativo bajo costo y (c) dificultades en el manipuleo y transporte. Fernández et al. (6) desarrollaron con bastante éxito un proceso de fermentación en sustrato sólido (FSS) con hongos filamentosos para pescado. La FSS es un proceso de bioconversión, caracterizado generalmente por el crecimiento del microorganismo en partículas sólidas en ausencia de agua libre. La FSS se torna atractiva principalmente por el uso de una tecnología relativamente simple, el reducido volumen del equipo por unidad de sustrato bioconvertido y por la aplicación directa en la fermentación de alimentos, aumentando su digestibilidad. La FSS tiene un gran potencial en el futuro por su aplicación socio-económica en la producción de un alimento rico en proteína para consumo humano y animal. Este proceso elimina los problemas anteriores y el producto tiene bajo contenido de agua, se manipulan volúmenes menores y se facilita el uso y transporte, pudiendo ser implantado a nivel de pequeña empresa. La tecnología propuesta plantea un aprovechamiento racional de materia prima y reduce la contaminación.

La tecnología utilizada fue la diseñada por Fernández et al. (6) con algunas modificaciones. El flujo de procesamiento se observa en la Figura 1. La materia prima utilizada fueron los residuos de pescado constituidos por vísceras, cabeza, espinazo y restos de carne, obtenidos en el Terminal Pesquero del Callao. Los residuos fueron trasladados al laboratorio en cajas isotérmicas para su conservación, al inicio del proceso se realizó una molienda de los residuos para homogeneizar el tamaño de partícula, luego se procedió a la cocción del material a 80° C por 20 minutos, con el objeto de liberar agua y aceite. Luego se filtró y prensó la masa cocida para retirar los líquidos (agua y aceite) hasta una humedad de 55-60%. La masa luego fue disgregada y colocada en bolsas de polietileno de mediana densidad formando una cama de 3 cm de altura. Las bolsas así acondicionadas fueron luego esterilizadas a 121° C por 60 minutos. Paralelamente, se preparó un cultivo del hongo de Rhizopus oryzae NRRL 395 (considerada GRASS) hasta la esporulación, se adicionó por aspersión y en condiciones asépticas una suspensión de 150 ml y 2 x10⁷ esporas/ml, a través del orificio de ventilación de la bolsa esterilizada. Luego se colocó el sistema de aireación en las bolsas y fueron, posteriormente, colocadas en la estufa para su fermentación a 30° C por 48 a 72 horas. El producto obtenido fue secado en estufa al vacío y envasado en bolsas de polietileno de mediana densidad.

Los métodos de análisis fueron los siguientes: composición química proximal (7,8); proteínas solubles, método de Lowry citado por Eisenthal (9); azúcares reductores, según Miller (10), relación de eficiencia proteica (PER) (11); numeración de gérmenes aerobios viables (12); numeración de hongos, Salmonella y Clostridium (13); grado de hidrólisis de la proteína, según Adler-Nissen (14). Se elaboró un Perfil Económico para tener una idea preliminar de la bondad económica del proyecto es caso de ser implementado.

3.1.- Composición química proximal

La composición química de los residuos frescos de pescado e hidrolizado seco, se aprecia en el Cuadro 1.

Cuadro 1. Composición química proximal de los residuos frescos e hidrolizados (%)

b.h. base húmeda, b.s. base seca
(a)Hidrolizado de residuos por FSS, presente estudio
(b)Hidrolizado de sardina por FSS, Fernández et al. (6)
(c)Hidrolizado de sardina, Ruiz y Pizardi (4)
(d)Concentrado Proteico de Pescado tipo A(según FAO), Ruiz y Pizardi (4)

3.2.- Parámetros del proceso

De acuerdo al protocolo de trabajo establecido en el proyecto, se llegó a establecer las condiciones más adecuadas de cultivo de Rhizopus oryzae sobre los residuos sólidos de pescado. Los desechos utilizados estuvieron conformados aproximadamente por 50% de vísceras y 50% de cabeza, huesos, restos de músculo, piel, escamas y aletas. Estos residuos fueron molidos y cocidos a 80° C por 20 minutos, luego fueron prensados. Se observó contaminación en algunas bolsas por lo que se decidió esterilizar el sustrato. Los residuos se dispusieron en los envases de fermentación y fueron esterilizados. Posteriormente, se enfriaron e inocularon con 2 x10⁷ esporas/30g a 60% de humedad y se incubó a 30° C.

El rendimiento obtenido en el producto fue de 24% esto hace una relación materia prima: producto tal como 4.17 .

a) Glucosa y sacarosa

Los resultados de la evaluación cualitativa del crecimiento miceliar cuando las fuentes carbonadas fueron glucosa y sacarosa (5 y 10% w/w) se presentan en el Cuadro 2. Donde la humedad inicial de los sistemas (H) dependieron del tipo de fuente carbonada y fueron:

• Glucosa H = 50.19%

• Sacarosa H = 49.19%

Cuadro 2. Evaluación cualitativa del crecimiento miceliar de Rhizopus oryzae según el tipo y concentración de fuente carbonada

En el Cuadro 2 se aprecia que independientemente del tipo de fuente carbonada hubo un crecimiento del microorganismo desde las 24 horas y aumentando hasta las 48 horas para luego mantenerse constante. Además, el tipo de fuente carbonada y la mayor concentración de ésta ha influenciado en el mejor crecimiento miceliar de tal forma que cubrió la superficie y penetró en todo el sustrato, siendo mayor con glucosa.

Por otro lado, el cambio continuo del pH estuvo influenciado por el tipo y concentración de fuente carbonada. En presencia de sacarosa, sólo a 10% (w/w) se logró una ligera acidificación en las primeras 24 horas, en cambio con glucosa el descenso del pH fue mayor y se mantuvo ácido hasta el término de la fermentación. A concentraciones de 5% (w/w) de glucosa y sacarosa el pH fue ascendiendo hasta el final del proceso, probablemente debido a la alta formación de grupos aminos.

b) Glucosa, sacarosa y almidón

Los resultados de la evaluación cualitativa del crecimiento miceliar cuando las fuentes carbonadas fueron glucosa, sacarosa y almidón (5 % w/w) se muestran en el Cuadro 3. Donde la humedad inicial del sistema para las tres fuentes carbonadas fue 58.3%. 

Cuadro 3. Evaluación cualitativa del crecimiento miceliar de Rhizopus oryzae para tres tipos de fuente carbonada

En el Cuadro 3 se puede observar que el crecimiento se dio en todos los casos, siendo mejor para los cultivos con glucosa y sacarosa; sin embargo, con almidón a las 72 horas el micelio sobre la superficie disminuyó. Por otro lado, sólo se observa descenso del pH con glucosa a las 24 horas y un ligero incremento a las 48 horas; con sacarosa se apreció que el pH fue estable a las 24 horas para luego incrementar significativamente, a diferencia del almidón con el cual el pH se incrementó desde el principio. Esto probablemente debido a que la fuente carbonada presente no fue suficiente para la formación de biomasa y estaría cambiando su metabolismo excretando metabolitos inconvenientes.

La variación de la concentración de azúcar en el medio fermentativo, según el tipo de fuente carbonada, se muestra en el Cuadro 4.

En el Cuadro 4 se puede observar que independientemente del tipo de la fuente carbonada hay un continuo consumo del azúcar, siendo mayor la tasa de consumo en las primeras 24 horas sobretodo con glucosa, con almidón y sacarosa el consumo fue lento.

Teniendo en cuenta los resultados de los Cuadros 3 y 4, se puede afirmar que la fermentación de los azúcares no se traduce necesariamente en una disminución de pH del sistema en estudio.

Con el fin de acelerar la fermentación, se acidificó inicialmente el sustrato con HCl diluido

utilizando glucosa y sacarosa como fuentes carbonadas.

Para la presente evaluación, las condiciones del cultivo fueron:

• pH inicial del sustrato sin acidificar: 6. 98
• Humedad inicial del sistema: 54.8%

Los resultados para esta evaluación se muestran en el cuadro 5.

Los resultados muestran que la acidificación inicial del sistema no favorece o acelera el crecimiento miceliar comparando los resultados obtenidos anteriormente, más bien después de las 24 horas el crecimiento miceliar se vio afectado retardándose y disminuyendo a las 72 horas.

El cambio de pH si es diferente entre ambas fuentes carbonadas, el incremento es mucho mayor

con sacarosa posterior a las 48 horas, en este periodo no se observó diferencias notorias de crecimiento entre ambas fuentes.

3.4 Hidrólisis del sustrato

3.4.1 Proteínas solubles y tasa de consumo

Luego de determinar las condiciones más adecuadas de desarrollo del R. oryzae, se evaluó la actividad proteolítica del hongo. Se decidió: esterilizar el sustrato antes de la inoculación del cultivo, aumentar el volumen del sustrato y usar sacarosa o no.

Los resultados de la liberación de proteínas solubles y utilización del sustrato se presentan en el Cuadro 6 y en las Figuras 2, 3 y 4 .

* p.s.: peso seco

Figura 2. Tirosina (tir./kg p.s.) en frascos de cultivo con sacarosa 5% (w/w)

Figura 3. Tirosina (tir./kg p.s.) en frascos de cultivo sin sacarosa

De los datos indicados en el Cuadro 6, se demuestra que si hubo un efecto producido en la liberación de polipéptidos aún en ausencia de sacarosa, durante todo el proceso fermentativo, siendo mayor en frascos sin sacarosa. Esta misma conducta se repitió cuando se trabajó con volúmenes mayores ( 500 g). Las Figuras 3 y 4 muestran esta tendencia de la curva con un continuo ascenso por acción del microorganismo.

Por otra parte, en el cuadro anterior, se puede apreciar un continuo descenso del peso seco, siendo mayor en las primeras 24 horas y más en cultivos en bolsas. También se puede observar que la utilización del sustrato a las 72 horas fue 32.15% en frasco con sacarosa y cerca de 45% en bolsa sin fuente carbonada. Esto indica la gran capacidad proteolítica del microorganismo, influenciada además por las condiciones favorables del cultivo relacionadas al diseño de la bolsa.

Los resultados de la variación en la concentración de azúcar residual en frascos conteniendo sacarosa, se muestran en el Cuadro 7 y en la Figura 5.

Cuadro 7. Variación del consumo de sacarosa por R. oryzae en frascos de cultivo

En el cuadro 7 se aprecia que el R. oryzae degrada y consume la sacarosa lentamente, así a las 72 horas la tasa de consumo fue de apenas 11.9% y a las 96 horas de 28.4%. Esto demostró que el hongo no utiliza la fuente carbonada para hidrolizar el sustrato tal como se aprecia en el cuadro 6.

3.4.2. Grado de hidrólisis

Los resultados del grado de hidrólisis se observan en las Figuras 6 , 7 y 8 . La evolución de las curvas es similar en los tres casos analizados, incrementando en razón directa al tiempo de proceso e indistintamente de la presencia de sacarosa o no. Se demuestra nuevamente que la hidrólisis se produce sin ser necesario que el hongo utilice sustancialmente la fuente carbonada (Figuras 6 y 8 ). También, se observa que esta conducta se presenta a diferentes volúmenes de sustrato.

Figura 7. Grado de hidrólisis de a - aminos grupos de L-leucina (g leuc./kg p.s.) durante la fermentación en frascos de cultivo conteniendo sacarosa 5% (w/w)

3.5. Análisis del producto final

3.5.1. Análisis microbiológico

Los resultados del análisis microbiológico se notan en el Cuadro 8. Se han incluido algunos requisitos de otros productos a modo de comparación.

CPP: concentrado proteico de pescado
*Presente estudio,** Ruiz y Pizardi (4), *** Rolz y De Cabrera (16)

3.5.2 Evaluación biológica

Los resultados del PER de diferentes concentrados proteicos de pescado se observan en el Cuadro 9. Se han incluido otros datos a manera de comparación.

Cuadro 9. Comparación entre valores PER promedios de diversos tipos de concentrado proteico de pescado

*PER (caseína)=2.5
**PER (producto) = 2.55

3.6. Perfil económico

Se elaboró un perfil económico para un nivel de producción de harina de 350 Ton/año, 2 cámaras de fermentación, precios iniciales de harina $ 275 Ton y aceite $ 180/TM, 10 meses de trabajo y los costos restantes fueron estimados de acuerdo a la escala de producción. Los resultados se observan en los Cuadros 10, 11 y 12.

Cuadro 10. Ingresos y costos totales para el proyecto hidrolizado de residuos de pescado

Financieros:

   Intereses Generales
   Intereses Adicionales
          TOTAL

Tasa de actualización      10%

ESTRUCTURA DE LA INVERSIÓN Y FINANCIAMIENTO

Recursos propios                     30,375
Línea de Crédito General:       91,125
Línea de Crédito Adicional:
         TOTAL                       121,500

Cuadro 11. Estado de ganancias y pérdidas financiero para el proyecto hidrolizado de residuos de pescado ($USA)

Cuadro 12. Flujo de caja financiero para el proyecto hidrolizado de residuos de pescado ($USA)

4.1. Análisis químico de los residuos de pescado e hidrolizado seco

En el Cuadro 1 se puede observar el alto contenido de grasa en el hidrolizado seco (10% en base seca), debido a la aportación de las vísceras principalmente, a pesar que la operación de cocción redujó drásticamente la fracción grasa (de 21.65% a 10.27%).

También, se observa un alto contenido de proteína total en el hidrolizado seco (67.19% en base seca), provocada principalmente por una variación en el contenido relativo de grasa y humedad. El contenido de humedad del hidrolizado seco (2.62%) estuvo dentro del rango exigido para este tipo de productos (menor a 10%) (3, 20), lo que garantiza su largo periodo de almacenamiento y estabilidad ; en tanto que el alto contenido de ceniza, estaría atribuido a la presencia de huesos cuya composición es básicamente minerales. Estas características, convierten al hidrolizado seco en un buen alimento que podría ser usado como complemento en dietas alimenticias de animales y probablemente de humanos. En cuanto a sus características sensoriales, el hidrolizado seco presentó las siguientes características: textura seco pulvurenta, olor característico y color beige.

4.2 Proceso de hidrolizado

En el Cuadro 2 se aprecia que, independientemente del tipo de fuente carbonada, hubo un crecimiento del microorganismo para luego hacerse constante.Además, el tipo y la mayor concentración de fuente carbonada habrían influenciado en el mejor crecimiento miceliar de tal forma que ha podido cubrir la superficie y penetrar en todo el sustrato. La capacidad de colonizamiento del R. oryzae en sustratos de humedad intermedia (aprox. 50%) ha sido un factor importante en la fermentación, debido a que la restricción de agua libre en el sistema estimuló la mejor penetración de las hifas en el sustrato, así como una adecuada transferencia de gases que generaría una evaporación y un adecuado consumo del sustrato. Al respecto, Moo-Young et al. (21) y Mitchell (22) mencionan que muchos microorganismos son capaces de crecer sobre sustratos sólidos pero los hongos filamentosos pueden hacerlo eficientemente en ausencia de agua libre. Además, refieren que la principal ventaja de los hongos se debe a su forma de crecimiento por extensión apical, lo cual les permite una mejor colonización de las partículas del sustrato, así como la penetración en las mismas. Respecto a esto último, Prior et al. (23), refieren que la penetración de las hifas en el sustrato y la transferencia de gases como el oxígeno y dióxido de carbono entre el microrganismo y el exterior mejora cuando la humedad del sistema es baja (actividad de agua menor a 0.6), lo cual facilita la formación de espacios entre las partículas donde el microorganismo se adhiere.

A una concentración de 5% (w/w) de azúcar, el pH se incrementó desde el principio con sacarosa y almidón , en cambio con glucosa inicialmente disminuyó para luego también aumentar. Esto posiblemente debido a que la fuente carbonada presente no es suficiente para la formación de biomasa y estaría cambiando su metabolismo excretando metabolitos que alcalinizan el sistema o liberando grupos amino a partir de proteína o péptidos.

La tasa de consumo del azúcar por el hongo es mayor con glucosa, comparada con el almidón, permitiendo afirmar que el hongo metaboliza los azúcares utilizados; sin embargo, es más eficiente con la glucosa.

En base a estos resultados se consideró excluir el almidón como fuente carbonada, debido que fue inapropiado para un buen crecimiento de R. oryzae, además que la disminución del volumen miceliar podría ser evidencia que hay producción de metabolitos o sustancias tóxicas.

La acidificación inicial del sustrato no dio los resultados esperados; más aún fue perjudicial pues retardó e impidió el normal crecimiento del hongo.

La proteólisis producida sobre el sustrato (Cuadro 6) mostró que el proceso de bioconversión se lleva a cabo en presencia o ausencia de sacarosa, tanto en frascos como en bolsas. Este resultado expresaría que la sacarosa no estaría siendo utilizada como única fuente que permita sintetizar enzimas proteolíticas, sino que estaría utilizando la fracción nitrogenada o la fracción grasa del sustrato para su metabolismo. Por otra parte, se puede apreciar un continuo descenso del peso seco, siendo mayor en las primeras 24 horas y más aún para cultivos en bolsas. Esta disminución del sustrato estaría atribuido a dos factores principales, primero al calor metabólico producto de la transferencia de gases que generaría un evaporación, y segundo al consumo del sustrato para el metabolismo del sustrato. Al respecto, Fernández et al. (6), Moo-Young et al. (21) y Hesseltine (24) mencionan que en una FSS se produce una transferencia de gases a dos niveles: intra e interpartículas, el primero está referido a la difusividad de nutrientes, produciéndose un gradiente de concentración, influenciado por las características geométricas, estructurales y de adsorción de las partículas y, el segundo nivel, producido por el intercambio de gases entre el microorganismo y el exterior. Además, este calor metabólico no puede evitarse, lo que provoca evaporación del sustrato como habría ocurrido en este caso.

Respecto al grado de hidrólisis, se puede apreciar una curva con tendencia ascendente de la liberación de a -aminos grupos, aumentando los grupos reactivos de L-leucina y la solubilidad durante el proceso de hidrólisis. Adler-Nissen (14) refiere que el curso de una reacción de a -aminos grupos primarios con TNBS describe una curva que se aproxima a un modelo matemático lineal de primer orden; por su parte, Ruiz (17) demostró que la hidrólisis de sardina en fermentación sumergida con Lactobacillus plantarum sigue una reacción de primer orden en relación inversa a la disminución del pH. Este comportamiento de la curva expresaría la alta capacidad proteolítica que tiene el pool de enzimas excretadas por R. oryzae.

4.3 Análisis del producto final

Los resultados del análisis microbiológico muestran un producto con una baja carga microbiana y ausencia de patógenos, estando dentro de los rangos máximos recomendados. Esto garantiza la sanidad del producto pudiendo ser usado tanto para consumo humano y animal.

Referente al análisis biológico del producto y, de acuerdo con los valores obtenidos (Cuadro 9), se aprecia que el PER del producto (2.55) mostró un alto valor biológico, pues para que una proteína sea adecuada como alimento es necesario que exhiba un PER mínimo de 2.0 (25); más aún , este valor es similar al de la caseína (2.50) lo cual la torna en una excelente proteína.

El rendimiento hallado en el proceso tecnológico mostró que es similar al de harina de pescado "prime" y muy superior al de la harina de residuos (5.0 – 6.0) (1), expresando que el proceso de hidrólisis definido en el presente estudio es altamente beneficioso.

4.4 Perfil Económico

El perfil económico mostró que, el implementar a nivel de pequeña empresa el proceso tecnológico de hidrólisis vía FSS con hongos, es rentable con una TIRF de 55%, esto hace al proyecto muy interesante desde el punto de vista de la inversión; sin embargo, es necesario elaborar un estudio de pre-factibilidad técnico económico.

Como conclusión general, se puede mencionar que la tecnología definida en esta investigación demostró que a partir de los residuos de pescado es posible obtener un producto de alto valor biológico a ser utilizado como alimento para consumo animal, siendo potencial su uso en la alimentación humana ; en tanto que , el análisis económico a nivel de perfil evidenció la alta rentabilidad del proyecto. Por lo tanto, desde el punto de vista científico, tecnológico y económico, el presente estudio determinó la factibilidad del proyecto.

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Foto 1. Residuos frescos de pescado utilizados en la fermentación del sustrato sólido

Foto 2. Residuos de pescado cocidos y prensados

Foto 3. Residuos de pescado fermentados en frascos con Rhyzopus orizae a las 48 horas de proceso

Foto 4. Residuos de pescado fermentados en bolsas de 500 g. con Rhyzopus orizae a las 24 horas de proceso

Foto 5. Proceso de fermentación en sustrato sólido (FSS) a tres niveles de escalamiento: 30 g, 500 g y 3 Kg

Foto 6. Residuos de pescado hidrolizados por FSS

Foto 7. Proceso experimental de FSS de residuos de pescado en lechos de 10 Kg.

Foto 8. Hidrolizado en polvo de residuos de pescado molidos y envasados en bolsas de polietileno